免疫放射分析技术
1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法,为了与放射免疫分析区别,故称免疫放射分析技术(immunoradiometric assay,IRMA)。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂,在反应体系中加入过量的抗体,待测抗原(或标准品)与和核素标记抗体进行全量反应,故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有以下特点:
1、IRMA反应系统中应用的标记物为免疫球蛋白。易于提纯和进行碘化标记,标记抗体的比活度较高,有利于提高分析的灵敏度,且不同抗体的标记方法基本相同;而在RIA中应用的标记物是抗原。抗原种类繁多,化学结构各异,较难获得纯品,标记方法亦多种多样。
2、在IRMA反应系统中使用过量的标记抗体,直接与抗原结合,不存在竞争结合的复杂反应,因此反应速度较快,即使使用亲和力较低的单可隆抗体,也能满足实验要求;而在RIA中抗体是微量的,所以一定要用高亲和力的多可隆抗体
3、IRMA使用的标记抗体和固相抗原在反应中都是过量的,只有待测样品加样误差才会影响分析结果,因此IRMA的批内和批间变异(CV%)比较小;而RIA使用的抗体和标记抗原在反应中是固定量的,加样误差可严重影响测定结果。
一、基本原理
将核素标记在抗体上,然后以过量的标记抗体与待测抗原结合,未结合的标记抗体通过和固相的抗原免疫吸附剂结合而去除,溶液中的放射性与待测抗原的含量呈正相关。根据检测过程的操作步骤不同,有以下几种类型
1、直接IRMA法
将待测抗原与过量的标记抗体进行温育,使二者结合,然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育,吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物,测定上清液中放射性强度,根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。
2、双抗体夹心IRMA法
在待测抗原内依次加入固相抗体和标记抗体,反应后形成固相抗体(Ab1)-抗原-标记抗体(Ab2)复合物,洗涤去除游离的标记抗体,测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射性强度,根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。此法仅用于检测有多个决定簇的多肽和蛋白质抗原。
3、间接IRMA法
此法是在上述双抗体夹心法的基础上,进一步改良为用核素标记抗Ab2的抗体(羊抗兔或抗鼠的IgG),反应后形成固相抗体(Ab1)-抗原-Ab2-*Ab3(标记抗抗体)的四重免疫复合物。其中,Ab3可作为通用试剂,可省去标记针对不同抗原的特异性抗体。
4、BSA-IRMA法
是将生物素-亲合素系统(BSA)引入免疫放射分析,建立的新一代IRMA。此法最大的优点是使用生物素化抗体和以核素标记亲合素为示踪剂,可以通用于甾体类、前列腺素等小分子物质的检测。由于1个抗体分子上可标记数十个生物素分子,而每个亲合素又可与4个生物素分子结合,从而产生多级放大效应。同时生物素与亲合素之间的亲和力要比抗原抗体间的亲和力大10万-100万倍,二者结合极为稳定,因此,使其灵敏度、特异性和精密度都大大提高。目前一些超灵敏度的IRMA分析试剂盒就是应用上述原理制成的。
二、基本试剂及材料
1、标记抗体
2、固定抗原吸附剂
3、标准抗原
4、待测样本
5、γ计数仪和低温离心机
三、操作方法
以固相双抗体法测定血清中促甲状腺素(TSH)为实例
1、按下表逐一加样(加样量为ml,均设双复管)
混匀,37℃温育120min
弃上清(T*除外,以下同),加2ml洗涤液,放置2min
弃上清,再加2ml洗涤液,放置2min
弃上清,将各管倒置在吸水纸上
2、用γ计数仪分别测量各管放射性强度,以两管cpm的均值表示,分别计算结合率(B%,即B/T* ´100%)
3、用B%为纵坐标,不同浓度的TSH标准品为横坐标绘制标准曲线,然后根据检测管的B%,从标准曲线中即可查得相应的TSH含量。